Pour en savoir plus sur le développement de méthode SPE, consultez notre article : Développement de méthode SPE, les principaux paramètres, les étapes du protocole pour un développement de méthode robuste, reproductible et répétable.
Le choix du bon adsorbant est déterminant pour vos préparations d’échantillons, découvrez notre guide pour optimiser vos résultats. Volume, Silices ou polymères, ne laissez rien au hasard…
Quels sont les volumes nécessaires ?
Pour les étapes de conditionnement, de lavage et d’élution, les volumes théoriques sont de 2 à 3 fois le volume de l’adsorbant ou “volume lit” soit :
- Pour 100 mg de silice 60 A 50 μm : environ 12 μl
- Pour 500 mg de silice 60 A 50 μm : environ 600 μl
- Pour 100 mg de polymère : environ 180 μl
Quelles sont les conséquences d’une masse d’adsorbant inadaptée ?
Une masse d’adsorbant trop élevée induit une élution incomplète des composés d’intérêt ou une dilution de l’échantillon par un volume d’élution trop important.
A l’inverse, une masse d’adsorbant trop faible induit une rétention incomplète des composés d’interêt que l’on retrouve dans la fraction de percolation ou dans le solvant de lavage.
Ces deux situations conduisent à des taux de récupération plus faibles que prévus.
Comment choisir l’adsorbant SPE ?
Quel que soit l’échantillon à purifier (qu’il soit issu de l’environnement, du domaine pharmaceutique, du domaine cosmétique, de l’agrochimie, ect.), il est fondamental de choisir son adsorbant d’extraction sur phase solide de façon précise.
Le choix de cet adsorbant permettra de définir une sélectivité spécifique aux composés d’intérêt ainsi qu’une capacité de charge suffisante à l’entière adsorption de ceux-ci.
On rencontre en général deux grandes familles :
- Les silices
- Les polymères
Leurs caractéristiques étant très différentes, leurs applications, avantages et inconvénients sont divers et variés.
Les polymères
Ils présentent l’avantage d’être stables chimiquement, ils résistent le plus souvent à un pH compris entre 1 et 14.
Ils sont faiblement sélectifs comparés aux silices greffées (exceptés les polymères échange d’ions).
Ils possédent une capacité de charge bien supèrieure aux silices traditionnelles et permettent la purification d’un très grand nombre de molécules ou de familles de molécules quelle que soit la matrice ( eaux, huiles, plasma, urines, …)
Les polymères à très hautes surfaces spécifiques sont particulièrement efficaces pour la préconcentration de composés polaires.
A savoir : La masse de composés adsorbables peut aller jusqu’à 30% de la masse de polymère contenue dans la colonne. Il est donc possible de réaliser le même travail de purification avec une quantité de polymères 2 à 3 fois moindre que celle d’une silice. Le volume d’élution est beaucoup plus faible, ce qui conduit à une concentration plus importante, une durée de l’évaporation réduite et par conséquences une préparation d’échantillon plus rapide.
Les silices
Leur stabilité chimique est moins importante que les polymères, elles sont stables à un pH compris entre 2 et 7,5.
Elles sont beaucoup plus sélectives que les polymères avec une capacité de charge moins importante du fait de leur plus faible surface spécifique ( de l’ordre de 3 à 10% de la masse d’adsorbant), les silices restent toujours des adsorbants de référence très utilisés.
On distingue 4 familles de silices différenciables par leur mode de fonctionnement et leur sélectivité :
- Silices pour mode ” Phase Inverse” :
En mode “Phase Inverse”, les greffons hydrophobes fonctionnent selon les interactions de type Van des Walls. La purification permet un isolement de familles de composés apolaires ou faiblement polaires.
L’ajout de tampon est préférable lorsque les composés sont ionisables (acides, bases).
Les phases apolaires non post-silanisées (non end capped) donnent, avec les groupements silanols superficiels, des interactions polaires supplémentaires qui peuvent améliorer la rétention des composés contenant des fonctionnalités polaires.
Pour un même éluant, plus la chaîne carbonnée est courte plus la rétention d’un composé est faible.
Pour les composés aromatiques, le greffage phényl présente de meilleures interactions. Le méthanol ou l’acétonitrile sont des solvants d’élution régulièrement utilisés.
- Silices pour mode ” Phase Normale” :
Le mode “Phase Normale” reste un compromis très interessant pour la purification de molécules ou familles de molécules dont la structure présente un grand nombre de fonctions polaires. Le choix du solvant est très important et influe directement sur le type d’interaction mis en œuvre pour la purification ( un solvant apolaire favorise les interactions polaires entre l’adsorbant et les composés).
- Silices pour mode “Echange d’ions” :
En mode “échange d’ions”, le mécanisme de rétention est l’intéraction ionique. L’extrémité du greffon de l’adsorbant crée une attraction forte avec le ou les composés de l’échantillon possédant une ou des fonctions ionisables antagonistes. L’intération des phases échangeuses d’ions dépend essentiellement du pH et de la force ionique du contre-ions. La force de la liaison sera d’autant plus importante que l’acide et la base qui s’apparient sont forts, ce qui peut être problèmatique pour l’étape d’élution et pour l’obtention d’un bon taux de recouvrement.
C’est pourquoi, il existe différents greffons échange d’ions :
– Les phases échangeuses d’anions ( SAX) sont généralement une amine quaternaire très forte. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charges négatives.
-Les phases échangeuses de cations (SCX) ayant une fonctionnalité sulfonique sont utilisées pour extraire tous les composés basiques faibles portant une ou des charges positives.
-Les phases échangeuses d’anions (DEAE, DEA, NH2….) sur une base d’amine moins forte que le SAX, sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charges négatives.
-Les phases échangeuses de cations (WCX) sont fonctionnalisées par un acide carboxilique et sont utilisées pour extraire tous les composés basiques forts portant une ou des charges positives.
- Silices pour mode ‘Mixed Mode” :
Une des techniques les plus sélectives des adsorbants silices greffées est celle du “mode mixte” ou “mixed mode”. Le double greffage (échange d’ions et chaînes carbonnées hydrophobes) apporte de nouvelles sélectivités. Les composés d’intérêt, qui doivent impérativement posséder une fonction acide ou basique, sont retenus sur le greffage échange d’ions. Un premier lavage puissant faisant intervenir le pH permet d’éliminer les impuretés ionisables. Il est ensuite possible d’éliminer les autres impuretés retenues sur le greffage hydrophobe par un solvant organique. Cette technique est très utilisée pour l’extraction de composés basiques (médicaments, drogues et métabolites) dans les fluides biologiques (sang, plasma, urines,…)
Comme en “échange d’ions”, il existe différents greffons spécifiques aux composés d’interêt :
-Les phases “mixed mode” (RP/SCX) sont constituées d’un acide fort (sulfonique) et d’un greffon hydophobe. Elles sont utilisées pour extraire les bases faibles portant une ou des charges négatives.
-Les phases “mixed mode” (RP/SAX) sont sur une base d’amine quaternaire et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charges négatives.
-Les phases ” mixed mode” (RP/WCX) sont constituées d’un acide faible (carboxylique) et de greffons hydophobes. Elles sont utilisées pour extraire les bases fortes portant une ou des charges négatives.
-Les phases “mixed mode” (RP/NH2) sont sur une base d’amine faible et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charges négatives.
En résumé, les avantages et inconvenients des silices et polymères :
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Les quantités d’adsorbants sont introduites par pesée avec une précision de +/-1%.
Un certificat de pesée est délivré avec chacune de nos plaques 96 puits attestant de la masse réelle introduite dans chaque puits.
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